Introduction à la PCR numérique

La PCR numérique (DPCR) est la technologie de PCR de troisième génération développée après PCR conventionnelle et PCR quantitative en temps réel (QPCR). Son principe central consiste à partitionner un mélange réactionnel contenant des molécules d'acide nucléique cible en dizaines de milliers d'unités de micro-réaction indépendantes (telles que des micro-départs ou des microwells), avec une amplification de PCR individuelle se produisant dans chaque unité.

Une fois l'amplification terminée, une détection de point final (généralement d'un signal de fluorescence) est effectuée sur chaque unité. La présence ou l'absence d'un signal détermine si cette unité contient la molécule d'acide nucléique cible. En comptant le nombre d'unités positives et en appliquant des statistiques de distribution de Poisson, le nombre de copie absolu de l'acide nucléique cible dans l'échantillon d'origine peut être directement calculé.

L'avantage central de la PCR numérique réside dans ses capacités de quantification absolue sans dépendance à une courbe standard, conduisant à des résultats plus précis et fiables. De plus, il a une tolérance plus élevée aux inhibiteurs et démontre une excellente sensibilité dans la détection des cibles d'abondance extrêmement faible, telles que des mutations rares, des agents pathogènes et de l'ADN tumoral circulant (CTDNA).

Ces caractéristiques ont permis au DPCR de montrer une valeur d'application et un potentiel énormes dans la recherche en sciences de la vie et les diagnostics cliniques, y compris des domaines tels que la biopsie du liquide tumoral, le diagnostic prénatal non invasif, la détection précise des agents pathogènes, l'analyse de l'expression des gènes, la quantification des composants transgéniques et l'évaluation des étalons de référence.

Types de PCR numérique

La PCR numérique peut être largement classée en trois types principaux en fonction de la méthode de partitionnement utilisée pour séparer l'échantillon en de nombreuses unités de réaction individuelles:

PCR numérique à base de gouttelettes

Cette méthode partitionne le mélange de PCR en dizaines de milliers de minuscules gouttelettes d'eau dans l'huile, chacune agissant comme un microréacteur PCR indépendant. Les gouttelettes sont générées à l'aide de la microfluidique puis soumises à une amplification PCR. Après amplification, les gouttelettes sont analysées individuellement pour la fluorescence afin de déterminer les partitions positives ou négatives. Cette approche offre un nombre très élevé de partitions et est largement utilisée pour sa sensibilité et sa précision.

PCR numérique basée sur des puces

Dans cette approche, le mélange de PCR est partitionné en dizaines de milliers de microchambres ou de puits sur une puce ou une plaque microfluidique. Chaque puits contient un petit volume agissant comme une réaction de PCR isolée. Après amplification, l'imagerie de fluorescence ou le balayage indique le signal de chaque partition. Les systèmes DPCR basés sur des puces intègrent souvent le partitionnement, l'amplification et la détection des échantillons dans un seul appareil.

Méthodes hybrides

Il s'agit notamment des technologies de méthode de balayage basée sur des droplettes et de puces qui combinent les fonctionnalités des systèmes basés sur des gouttelettes et des puces. La pluviation a utilisé cette méthode. Tout d'abord, des dizaines de milliers de gouttelettes sont générées à l'aide de la microfluidique, puis les gouttelettes sont réparties en une seule couche sur une puce. Une fois la réaction de PCR terminée, les signaux de fluorescence sont collectés par imagerie de la même manière que la méthode basée sur la puce.

Chaque stratégie de partitionnement isole les molécules d'acide nucléique dans des compartiments de réaction séparés, permettant l'utilisation de statistiques de Poisson pour quantifier avec précision l'ADN cible ou l'ARN en comptant les partitions positives et négatives. Le choix de la méthode de partitionnement affecte le nombre de partitions, le volume de partition, la complexité du flux de travail et les exigences de l'instrument.

Statistiques de Poisson en PCR numérique

La distribution de Poisson est fondamentale pour la PCR numérique car elle modélise la probabilité qu'une partition donnée contient des molécules cibles nulles, une ou multiples. En considérant ces probabilités, les statistiques de Poisson permettent l'estimation précise du nombre moyen de molécules cibles par partition. Plus précisément, lorsque le volume moyen de chaque partition (VP) est connu, le modèle de Poisson peut être appliqué pour calculer la concentration absolue de molécules d'acide nucléique cible par volume unitaire.

L'informatique clé de la distribution de Poisson est que la fraction des partitions négatives (celles sans molécules cibles) reflète la probabilité de molécules nulles dans une partition, ce qui permet le calcul de l'occupation moyenne (λ) dans toutes les partitions. Cette approche corrige la possibilité que certaines partitions positives contiennent plus d'une molécule, empêchant la sous-estimation de la concentration cible.

Une mesure précise de chaque variable - partitions positives, partitions totales et volume de partition - est essentielle, car toute erreur peut affecter directement la précision de la détermination de la concentration en acide nucléique. Dans l'ensemble, la distribution de Poisson fournit le cadre statistique qui transforme les données binaires de partition positive / négative en une quantification absolue et très précise des molécules cibles dans la PCR numérique.

Comment calculer des copies / gouttelettes et des copies / µl dans la PCR numérique?

Le nombre total de copies de la molécule cible dans toutes les gouttelettes valides d'un échantillon est calculé en multipliant les copies de la molécule cible par gouttelettes avec le nombre de gouttelettes valides. Sur la base du nombre connu de copies de la molécule cible par gouttelette (λ) et du volume de gouttelettes, les copies par microlitre peuvent également être calculées.

Formulas for calculate copies/droplet and copies/µL in digital PCR

La concentration d'ADN cible dans le sang d'origine de 2 ml est d'environ 35 846 exemplaires / ml.

Quel est le flux de travail de la série Digital PCR Dropdx?

Le flux de travail PCR numérique est simple. Il englobe généralement les étapes suivantes:

1. Préparation du mélange réactionnel

Le flux de détection de PCR numérique (DPCR) commence par l'extraction de l'acide nucléique de l'échantillon à l'isolat de l'ADN ou de l'ARN. Après extraction, les acides nucléiques purifiés sont mélangés avec PCR Mastermix, y compris les amorces, les sondes fluorescentes, les nucléotides, les enzymes et un supermix spécialisé conçu pour la formation de gouttelettes.

2. Chargement d'échantillon

3. Génération de gouttelettes et PCR

4. lecture des puces et analyse des données

Quel est le flux de travail de la série Digital PCR RS32?

Le système de PCR numérique tout-en-un RS32 propose un flux de travail entièrement automatisé 'Exemple-in, résultat '. Après la préparation d'échantillons simples et le chargement de l'échantillon sur la puce, les utilisateurs n'ont qu'à définir les paramètres requis. Une fois la puce placée dans la machine RS32, l'ensemble du processus de détection se déroule automatiquement sans autre intervention manuelle. Ce processus rationalisé élimine le besoin d'étapes pratiques pendant l'analyse, réalisant l'automatisation complète de l'entrée de l'échantillon à la sortie du résultat.

Avantages et limitations de la PCR numérique

Avantages:

Avantage	Description
Quantification absolue	Compte directement les molécules cibles sans avoir besoin d'une courbe ou d'une référence standard, améliorant la fiabilité.
Haute précision et reproductibilité	Fournit des résultats plus précis et reproductibles, en particulier pour les cibles à faible abondance et les petits changements de pli.
Sensibilité supérieure	Détecte des concentrations extrêmement faibles de cibles, telles que les mutations rares, les agents pathogènes et l'ADNmt.
Tolérance élevée aux inhibiteurs	Le partitionnement réduit l'impact des inhibiteurs de la PCR, permettant une quantification robuste même dans des échantillons difficiles.
Aucune dépendance à l'égard de l'efficacité de l'amplification	Les résultats sont moins affectés par les variations de l'efficacité de la PCR, conduisant à une quantification plus précise.

Inconvénients:

Inconvénient	Description
Gamme dynamique plus étroite	Le nombre limité de partitions restreint la plage de concentrations cibles qui peuvent être quantifiées avec précision, nécessitant souvent une dilution de l'échantillon pour des cibles très abondantes.
Coût plus élevé	L'équipement et les consommables pour le DPCR sont généralement plus chers que ceux du qPCR.
Débit plus bas	DPCR traite généralement moins d'échantillons par exécution.
Variété de kit de réactif limité	Les kits de réactifs commercialisés sont encore limités dans la variété, et même moins de kits ont obtenu une qualification pour une utilisation dans les hôpitaux.
Kits de réactifs non interchangeables	Étant donné que les méthodes de partitionnement diffèrent, les kits de réactifs de différents fabricants de PCR numériques ne sont pas interchangeables.

Comparaison entre la PCR numérique et QPCR

QPCR est idéal pour les expériences à haut débit avec une large gamme dynamique et des résultats rapides. Il est quantitatif mais nécessite généralement des courbes ou des références standard, et sa précision peut être affectée par les inhibiteurs et l'efficacité de la PCR.

DPCR offre une quantification absolue sans normes, excelle dans la sensibilité et la précision des cibles à faible abondance ou rares, et est plus tolérante aux inhibiteurs. Le choix entre qPCR et DPCR dépend des objectifs de l'expérience, du type d'échantillon et de la sensibilité requise.

Tableau comparatif: qPCR vs DPCR

Fonctionnalité / aspect	PCR en temps réel (qPCR)	PCR numérique (DPCR)
Quantification	Relatif ou absolu (nécessite des courbes ou des références standard)	Absolu (pas de normes ou de références requises)
Format de réaction	PCR en vrac, volumes de réaction flexibles	Échantillon de partitionnement, volumes de partition fixe
Impact de l'efficacité de la PCR	Impacu par les changements d'efficacité de la PCR (données collectées pendant la phase exponentielle)	Non affecté par les changements d'efficacité d'amplification
Tolérance aux inhibiteurs	Sujet aux inhibiteurs	Tolérance plus élevée
Méthode de détection	Détection en temps réel	Détection de point final
Plage dynamique	Large gamme dynamique	Gamme dynamique plus étroite
Sensibilité	Variation plus élevée, moins sensible aux cibles rares	Détecte de petits changements et des cibles rares, une sensibilité plus élevée
Reproductibilité	Modéré, peut être affecté par divers facteurs	Reproductibilité plus élevée
Pouvoir statistique	Inférieur	Plus haut
Maturité du protocole	Protocoles bien établis	Transition facile de QPCR, mais les protocoles se développent toujours
Déborder	Haut	Inférieur

Comparaison entre la PCR numérique (DPCR) et le séquençage de nouvelle génération (NGS)

La PCR numérique (DPCR) et le séquençage de nouvelle génération (NGS) sont des technologies complémentaires en biologie moléculaire et diagnostic clinique. Plutôt que de concurrence, ils sont souvent utilisés ensemble pour maximiser la puissance analytique:

NGS est idéal pour une large découverte, identifiant un large éventail de variantes génétiques et de biomarqueurs sans connaissance préalable des mutations. Il est fondamental pour le DPCR complet fournit une validation ultrasensible et une quantification précise de cibles spécifiques, ce qui le rend adapté au suivi des mutations connues ou des variantes rares au fil du temps, en particulier dans la surveillance de la réponse au traitement.

Ngs	PCR numérique	PCR numérique
Limite de détection	10% -5% pour WGS et WES	0,1% -0,001%
Analyse des données	Support bioinformatique étendu, exigeant une interprétation des données	Direct
Exigence de connaissances de la mutation	Connaissance préalable des mutations non requises	Requis
Champ de détection	Des centaines à un génome entier ou entier	Limité
Quantification	Semi-quantitatif	Quantification absolue
Types de modifications détectées	Copier les modifications du nombre, les réarrangements structurels, les changements de SNV ou de méthylation sur le génome / panneaux entiers	Possible sur des gènes / régions uniques
Temps de redressement (TAT)	Long	Court
Coût	Haut	Faible

Ces technologies sont souvent intégrées dans les flux de travail: NGS pour la découverte et le profilage, suivis du DPCR pour une surveillance quantitative sensible des cibles sélectionnées. Cette synergie est particulièrement précieuse dans la médecine de précision, l'oncologie, la surveillance des maladies infectieuses et les tests génétiques.

Applications de PCR numérique

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